口腔扁平苔藓损害组织中幽门螺旋杆菌DNA的原位检测及其意义*
作者：张水龙 许国祺 曹宏康 钟文静
单位：200011上海，上海第二医科大学附属第九人民医院口腔内科
关键词：口腔扁平苔藓；幽门螺旋杆菌；原位杂交
临床口腔医学杂志990210 提 要 为了进一步探讨口腔扁平苔藓(OLP)与幽门螺旋杆菌(HP)的关系，本研究应用非放射性DIG系统的原位杂交技术对20例HP-PCR阳性的OLP患者作HP-DNA的检测。结果显示：在20例OLP的损害组织中，18例为HP-DNA阳性，2例为阴性，而对照组均为阴性。结果提示OLP损害组织中HP所致的病理变化可能是某些OLP的发病基础。
The detection and effect of helicobacter pylori in the lesions of oral lichen planus. Zhang Shuilong et al. Department of oral medicine, Ninth People's Hospital, Sha nghai Second Medical University, Shanghai 200011.
, 百拇医药
Abstract In order to discuss the relationship of or al lichen planus(OLP) and helicobacter pylori(HP),in situ hybridization was appl ied to detect HP-DNA in the lesions of 20 OLP cases who were HP-PCR positive. The result showed that 18 of 20 OLP cases had positiveness of HP-DNA and 2 nega ti veness. It is indicated that HP in the lesions of OLP may result in pathological change which may be the pathogenic basis of OLP.
Key Words Oral Lichen Planus Helicobacter Pylori In Situ Hybrid ization
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材料与方法
1.载玻片与盖玻片的处理
载玻片的处理：①将玻片插入染色架，加入含中性洗涤剂热水中处理至过夜；②用流水冲洗、晾干后，置清洁液中浸泡48h；③用流水冲洗干净，去离子水漂洗，晾干，干热180℃处理3h；④无水乙醇脱水30min，晾干；⑤配3×SSC、1×Denhardt's液，加热至65℃，将载玻片浸在上述液体中处理3h；⑥冷却后除去上述液体，用去离子水漂洗1min；⑦3∶1(乙醇：冰醋酸)浸育20min，晾干；⑧在2%氨丙基三乙氧基甲硅烷(APES)中浸10秒，丙酮轻洗，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水洗后，42℃温箱过夜，干燥，贮存备用。
盖玻片的处理：①中性洗涤剂浸泡过夜，用流水洗涤，晾干；②清洁液浸泡48h后流水冲洗，去离子水漂洗，晾干；③配5%硅油溶液，硅油用氯仿稀释，盖玻片放入5%硅油中片刻取出；④用去离子水漂洗2次；⑤80℃烘烤3h，收入盒中备用。
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2.标本的制备
取HP-PCR检测阳性的OLP石蜡标本20例。所有的标本均按原位杂交要求处理：①在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中4℃固定过夜；②70%、80%、90%、100%乙醇脱水(4℃、1h)；③将脱水的标本放入二甲苯中透明，每1～3h换3次后在4℃过夜；④60℃浸蜡3次，每次2h；⑤石蜡包埋，5μm连续切片，37℃温箱过夜，4℃干燥保存。上述处理过程中所有器具及溶液均按无RNA酶要求处理。
3.主要试剂
地高辛标记寡核苷酸加尾试剂盒、DIG核酸检测试剂盒及蛋白酶K均购自德国Boehringer Mannheim公司。DEPC、APES购自上海华美生物工程公司。其它试剂均为国产分析纯。
4.探针的制备
取HP-PCR检测试剂盒中的下游引物作为寡核苷酸探针(28个碱基)并经DNA合成仪合成而得。探针的标记：①依次将4μl加尾缓冲液、4μlCOCl2溶液、1.5μl寡核苷酸探针(100pmol)、1μlDIG-dUTP溶液、1μldATP溶液、1μl末端转移酶混合于Eppendorf管中后置于冰上；②37℃孵育15min，然后置于冰上；③取1μl糖原和200μl0.2MEDTA溶液混合(pH8.0)，从中取2μl加到反应混合物中以终止反应；④用2.5μl4MLiCl和75μl预冷的酒精(-20℃)绝对混合以沉淀加尾标记的寡核苷酸，-20℃放置2h；⑤在离心力12000g条件下离心30min，用70%(v/v)、50μl冷酒精清洗，冷冻真空干燥离心30min，溶解于100μl消毒双蒸水中，置-20℃冰箱贮存备用。
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5.原位杂交检测HP-DNA操作步骤[3，4]
5.1 切片的预处理
用吹风机吹干从冰箱中取出的切片，二甲苯脱蜡3次，每次10min，再依次放入100%、90%、80%及70%乙醇中各5min，0.1M、pH7.4PBS洗2次，每次15秒，0.2MHCL20min，2μg/ml蛋白酶K溶液(10mM Tris-HCLpH8.0.1mMEDTA)处理15min，0.2%甘氨酸.PBS各洗10min，用4%多聚甲醛后固定5min，PBS洗2次，然后用0.25%醋酸酐/0.1M三乙醇胺溶液(pH8.0)处理10min，PBS洗2次，最后分别用不同浓度乙醇(70%、80%、90%和100%)脱水，晾干。
5.2 杂交
新鲜配制杂交液：50%甲酰胺，4×Denhardt's，10%硫酸葡聚糖，0.5mg/ml变性鱼精DNA，0.25mg/ml酵母tRNA，10mM Tris-HCLpH7.4.1mMEDTA及标记探针，终浓度为1μg/ml。在组织切片上滴加杂交液50μl，上覆盖玻片，置95℃热板上6min，使靶DNA变性，然后将载玻片于冰上冷却1min，放入经50%甲酰胺湿润的湿盒内，42℃孵育3～8h。
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5.3 杂交后漂洗
杂交后，取出载玻片浸入2×SSC中，洗去盖玻片和杂交液。然后在摇床上先用2×SSC漂洗2次，每次15min，再以0.1×SSC42℃漂洗2次，每次15min，以去除非特异性结合的寡核苷酸探针。
5.4 显色检测
组织切片用1号地高辛缓冲液(100mMTris-HCLpH7.5.150mM NaCl)洗5min，置阻断液(含1.5%阻断剂的1号地高辛缓冲液)中孵育30min。将抗DIG抗体以1∶500稀释于1号地高辛缓冲液中，室温孵育1h，再用1号地高辛缓冲液在摇床上漂洗2次，每次15min，洗脱未结合的抗体。最后用3号地高辛缓冲液(100mM Tris-HCLpH0.5100mM NaCl50mM MgCl2)平衡3min后，用显色液(200μl NBT/BCIP加入3号地高辛缓冲液内)避光显色，确认充分发色后将切片浸入终止反应液(10mMTris-HCLpH7.6.1mMEDTA)中3min以终止反应，轻轻水洗后用水溶性封片剂(CrystalMount)封片，光镜观察结果。
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6.对照设立
正常对照：正常口腔颊粘膜作为正常对照；
阴性对照：杂交前以DNase处理切片；
空白对照：杂交液中不加标记探针；
阳性对照：取胃粘膜HP阳性者作为阳性对照。
结果
在20例中HP-DNA的DIG标记原位杂交阳性18例，阴性2例。HP-DNA存在于OLP损害组织中的棘细胞间或棘细胞内；对照组均为阴性。
讨论
原位杂交组织化学技术是指利用碱基序列已经明了的带有标记物的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸进行杂交，从而对组织细胞中的待测核酸进行定性、定位和相对定量的一种研究方法。
, 百拇医药
两个单链核酸分子的碱基序列互补，就可在一定条件下形成稳定的杂交分子，这样，如果组织细胞中存在与核酸探针碱基序列互补的核酸分子，这种核酸分子就可与核酸探针杂交，通过对核酸探针所带标记物的检测即可检出待测核酸。以地高辛配体(DIG)为主体的DIG系统于1988年首次问世。该技术避免了使用有碍安全的同位素，而且敏感性高、耗时少，故已成为分子生物学核酸分析技术的重要手段[5，6]。本研究应用地高辛加尾标记的寡核苷酸探针，杂交后的地高辛探针用碱性磷酸酶(AKP)标记的抗地高辛抗体显示，从而对待测核酸进行定位分析。
本研究结果显示，对HP-PCR阳性的组织标本进行HP-DNA的检测，发现在棘细胞间或棘细胞内均可检测到HP-DNA，证明HP的存在和OLP的发病密切相关，因为HP基因在组织中的存在是HP感染与复发所必需的条件，其中2例未发现HP-DNA，可能与组织中的HP-DNA拷贝数较少有关。虽然PCR方法不能确定HP在OLP损害组织中的位置，但可被原位杂交检测，故生化方法与形态学方法的有机结合，对于阐明某一疾病的发病机理具有重要意义。HP-DNA在组织中的出现，其可能机理为：①HP引发组织产生炎症反应，中性白细胞浸润并吞噬HP，继而中性白细胞坏死，释放所吞噬消化的HP，致使在组织中检测到HP-DNA；②HP通过类似病毒的作用，能通过某种途径将HP-DNA整合入宿主细胞；③上皮细胞可能有直接吞饮HP的作用[7]。
, 百拇医药
*本课题由深圳建安医药公司资助
参考文献
[1]Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli i n the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 1983;I:12 73～75
[2]Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomac h of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 1984;1:1311～15
[3]Lindeberg H.;Johansen, L. The presence of human papillomavirus (HPV ) in solitary adult laryngeal papillomas demonstrated in situ DNA hybridizat ion with sulphated probes. Clin Otolaryngol, 1990;15:367～71
, 百拇医药
[4]Heiles, H.B.J.;Genersch, E.;Kessler,C.;et al. In situ hybridizatio n with digoxigenin-labeled DNA of human papillomaviruses(HPV16/18) in Hela and Si Ha cells. Bio Techniques, 1988;6(10):978～81
[5]Kessler,C. The digoxigenin system:anti-digoxigenin applic ations o f the novel nonradioactive DNA labeling and detection system. Bio Technology Int . 1990,183～194
[6]Kessler, C. The digoxigenin system:anti-digoxigenin technol ogy a survey on the concept and realization of a novel bioanalytic indicator system. Mol Cell Probes 1991;5:161～205
[7]Parsonnet J. Helicobacter pylori and gastric cancer.Gastroenterol Clin North Am 1993,22(1):89～104
(收稿：1998—12—14), 百拇医药
单位：200011上海，上海第二医科大学附属第九人民医院口腔内科
关键词：口腔扁平苔藓；幽门螺旋杆菌；原位杂交
临床口腔医学杂志990210 提 要 为了进一步探讨口腔扁平苔藓(OLP)与幽门螺旋杆菌(HP)的关系，本研究应用非放射性DIG系统的原位杂交技术对20例HP-PCR阳性的OLP患者作HP-DNA的检测。结果显示：在20例OLP的损害组织中，18例为HP-DNA阳性，2例为阴性，而对照组均为阴性。结果提示OLP损害组织中HP所致的病理变化可能是某些OLP的发病基础。
The detection and effect of helicobacter pylori in the lesions of oral lichen planus. Zhang Shuilong et al. Department of oral medicine, Ninth People's Hospital, Sha nghai Second Medical University, Shanghai 200011.
, 百拇医药
Abstract In order to discuss the relationship of or al lichen planus(OLP) and helicobacter pylori(HP),in situ hybridization was appl ied to detect HP-DNA in the lesions of 20 OLP cases who were HP-PCR positive. The result showed that 18 of 20 OLP cases had positiveness of HP-DNA and 2 nega ti veness. It is indicated that HP in the lesions of OLP may result in pathological change which may be the pathogenic basis of OLP.
Key Words Oral Lichen Planus Helicobacter Pylori In Situ Hybrid ization
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材料与方法
1.载玻片与盖玻片的处理
载玻片的处理：①将玻片插入染色架，加入含中性洗涤剂热水中处理至过夜；②用流水冲洗、晾干后，置清洁液中浸泡48h；③用流水冲洗干净，去离子水漂洗，晾干，干热180℃处理3h；④无水乙醇脱水30min，晾干；⑤配3×SSC、1×Denhardt's液，加热至65℃，将载玻片浸在上述液体中处理3h；⑥冷却后除去上述液体，用去离子水漂洗1min；⑦3∶1(乙醇：冰醋酸)浸育20min，晾干；⑧在2%氨丙基三乙氧基甲硅烷(APES)中浸10秒，丙酮轻洗，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水洗后，42℃温箱过夜，干燥，贮存备用。
盖玻片的处理：①中性洗涤剂浸泡过夜，用流水洗涤，晾干；②清洁液浸泡48h后流水冲洗，去离子水漂洗，晾干；③配5%硅油溶液，硅油用氯仿稀释，盖玻片放入5%硅油中片刻取出；④用去离子水漂洗2次；⑤80℃烘烤3h，收入盒中备用。
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2.标本的制备
取HP-PCR检测阳性的OLP石蜡标本20例。所有的标本均按原位杂交要求处理：①在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中4℃固定过夜；②70%、80%、90%、100%乙醇脱水(4℃、1h)；③将脱水的标本放入二甲苯中透明，每1～3h换3次后在4℃过夜；④60℃浸蜡3次，每次2h；⑤石蜡包埋，5μm连续切片，37℃温箱过夜，4℃干燥保存。上述处理过程中所有器具及溶液均按无RNA酶要求处理。
3.主要试剂
地高辛标记寡核苷酸加尾试剂盒、DIG核酸检测试剂盒及蛋白酶K均购自德国Boehringer Mannheim公司。DEPC、APES购自上海华美生物工程公司。其它试剂均为国产分析纯。
4.探针的制备
取HP-PCR检测试剂盒中的下游引物作为寡核苷酸探针(28个碱基)并经DNA合成仪合成而得。探针的标记：①依次将4μl加尾缓冲液、4μlCOCl2溶液、1.5μl寡核苷酸探针(100pmol)、1μlDIG-dUTP溶液、1μldATP溶液、1μl末端转移酶混合于Eppendorf管中后置于冰上；②37℃孵育15min，然后置于冰上；③取1μl糖原和200μl0.2MEDTA溶液混合(pH8.0)，从中取2μl加到反应混合物中以终止反应；④用2.5μl4MLiCl和75μl预冷的酒精(-20℃)绝对混合以沉淀加尾标记的寡核苷酸，-20℃放置2h；⑤在离心力12000g条件下离心30min，用70%(v/v)、50μl冷酒精清洗，冷冻真空干燥离心30min，溶解于100μl消毒双蒸水中，置-20℃冰箱贮存备用。
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5.原位杂交检测HP-DNA操作步骤[3，4]
5.1 切片的预处理
用吹风机吹干从冰箱中取出的切片，二甲苯脱蜡3次，每次10min，再依次放入100%、90%、80%及70%乙醇中各5min，0.1M、pH7.4PBS洗2次，每次15秒，0.2MHCL20min，2μg/ml蛋白酶K溶液(10mM Tris-HCLpH8.0.1mMEDTA)处理15min，0.2%甘氨酸.PBS各洗10min，用4%多聚甲醛后固定5min，PBS洗2次，然后用0.25%醋酸酐/0.1M三乙醇胺溶液(pH8.0)处理10min，PBS洗2次，最后分别用不同浓度乙醇(70%、80%、90%和100%)脱水，晾干。
5.2 杂交
新鲜配制杂交液：50%甲酰胺，4×Denhardt's，10%硫酸葡聚糖，0.5mg/ml变性鱼精DNA，0.25mg/ml酵母tRNA，10mM Tris-HCLpH7.4.1mMEDTA及标记探针，终浓度为1μg/ml。在组织切片上滴加杂交液50μl，上覆盖玻片，置95℃热板上6min，使靶DNA变性，然后将载玻片于冰上冷却1min，放入经50%甲酰胺湿润的湿盒内，42℃孵育3～8h。
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5.3 杂交后漂洗
杂交后，取出载玻片浸入2×SSC中，洗去盖玻片和杂交液。然后在摇床上先用2×SSC漂洗2次，每次15min，再以0.1×SSC42℃漂洗2次，每次15min，以去除非特异性结合的寡核苷酸探针。
5.4 显色检测
组织切片用1号地高辛缓冲液(100mMTris-HCLpH7.5.150mM NaCl)洗5min，置阻断液(含1.5%阻断剂的1号地高辛缓冲液)中孵育30min。将抗DIG抗体以1∶500稀释于1号地高辛缓冲液中，室温孵育1h，再用1号地高辛缓冲液在摇床上漂洗2次，每次15min，洗脱未结合的抗体。最后用3号地高辛缓冲液(100mM Tris-HCLpH0.5100mM NaCl50mM MgCl2)平衡3min后，用显色液(200μl NBT/BCIP加入3号地高辛缓冲液内)避光显色，确认充分发色后将切片浸入终止反应液(10mMTris-HCLpH7.6.1mMEDTA)中3min以终止反应，轻轻水洗后用水溶性封片剂(CrystalMount)封片，光镜观察结果。
, http://www.100md.com
6.对照设立
正常对照：正常口腔颊粘膜作为正常对照；
阴性对照：杂交前以DNase处理切片；
空白对照：杂交液中不加标记探针；
阳性对照：取胃粘膜HP阳性者作为阳性对照。
结果
在20例中HP-DNA的DIG标记原位杂交阳性18例，阴性2例。HP-DNA存在于OLP损害组织中的棘细胞间或棘细胞内；对照组均为阴性。
讨论
原位杂交组织化学技术是指利用碱基序列已经明了的带有标记物的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸进行杂交，从而对组织细胞中的待测核酸进行定性、定位和相对定量的一种研究方法。
, 百拇医药
两个单链核酸分子的碱基序列互补，就可在一定条件下形成稳定的杂交分子，这样，如果组织细胞中存在与核酸探针碱基序列互补的核酸分子，这种核酸分子就可与核酸探针杂交，通过对核酸探针所带标记物的检测即可检出待测核酸。以地高辛配体(DIG)为主体的DIG系统于1988年首次问世。该技术避免了使用有碍安全的同位素，而且敏感性高、耗时少，故已成为分子生物学核酸分析技术的重要手段[5，6]。本研究应用地高辛加尾标记的寡核苷酸探针，杂交后的地高辛探针用碱性磷酸酶(AKP)标记的抗地高辛抗体显示，从而对待测核酸进行定位分析。
本研究结果显示，对HP-PCR阳性的组织标本进行HP-DNA的检测，发现在棘细胞间或棘细胞内均可检测到HP-DNA，证明HP的存在和OLP的发病密切相关，因为HP基因在组织中的存在是HP感染与复发所必需的条件，其中2例未发现HP-DNA，可能与组织中的HP-DNA拷贝数较少有关。虽然PCR方法不能确定HP在OLP损害组织中的位置，但可被原位杂交检测，故生化方法与形态学方法的有机结合，对于阐明某一疾病的发病机理具有重要意义。HP-DNA在组织中的出现，其可能机理为：①HP引发组织产生炎症反应，中性白细胞浸润并吞噬HP，继而中性白细胞坏死，释放所吞噬消化的HP，致使在组织中检测到HP-DNA；②HP通过类似病毒的作用，能通过某种途径将HP-DNA整合入宿主细胞；③上皮细胞可能有直接吞饮HP的作用[7]。
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*本课题由深圳建安医药公司资助
参考文献
[1]Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli i n the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 1983;I:12 73～75
[2]Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomac h of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 1984;1:1311～15
[3]Lindeberg H.;Johansen, L. The presence of human papillomavirus (HPV ) in solitary adult laryngeal papillomas demonstrated in situ DNA hybridizat ion with sulphated probes. Clin Otolaryngol, 1990;15:367～71
, 百拇医药
[4]Heiles, H.B.J.;Genersch, E.;Kessler,C.;et al. In situ hybridizatio n with digoxigenin-labeled DNA of human papillomaviruses(HPV16/18) in Hela and Si Ha cells. Bio Techniques, 1988;6(10):978～81
[5]Kessler,C. The digoxigenin system:anti-digoxigenin applic ations o f the novel nonradioactive DNA labeling and detection system. Bio Technology Int . 1990,183～194
[6]Kessler, C. The digoxigenin system:anti-digoxigenin technol ogy a survey on the concept and realization of a novel bioanalytic indicator system. Mol Cell Probes 1991;5:161～205
[7]Parsonnet J. Helicobacter pylori and gastric cancer.Gastroenterol Clin North Am 1993,22(1):89～104
(收稿：1998—12—14), 百拇医药